微生物多样性分析是基于Illumina测序平台，利用双末端测序（Paired-end）的方法， 构建小片段扩增子文库进行测序；通过对Reads拼接过滤，去噪，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品的物种构成；进一步进行Alpha多样性分析（Alpha diversity）、Beta多样性分析（Beta diversity）、显著物种差异分析、功能预测分析等，可以挖掘样本之间的差异。

微生物多样性研究是以扩增序列变体为分子标记研究环境样品中微生物系统分类、物种构成，主要是基于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行的。细菌主要是基于16S区，真菌主要基于ITS区（内转录间区），真核生物主要基于18S区进行测序分析。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列。这些序列中既有保守区又有可变区，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异[1-3]。

1、对原始测序序列进行质控，包括低质量过滤、长度过滤，得到高质量序列；

2、将高质量序列进行去噪，划分ASVs（Feature），并根据Feature的序列组成得到其物种分类；

3、基于特征（Feature）分析结果，对样本在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样本在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、分类学水平系统进化发生树及分类学树状图；

4、通过Alpha多样性分析研究单个样本内部的物种多样性，统计了各样本的Ace、Chao1、Shannon及Simpson等指数，绘制了样本稀释曲线；

5、通过Beta多样性分析来比较不同样本在物种多样性方面（群落组成及结构）存在的差异大小，根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类（UPGMA）树、降维分析（PCA、PCoA、NMDS）、样品聚类热图、Anosim分析等；

6、在物种分类学组成层面，通过组间差异显著性分析，进一步衡量不同样本（组）间的物种丰度组成差异，在不同组间寻找具有统计学差异的Biomarker；

7、根据16S rRNA或ITS基因测序结果，通过功能预测分析，对样品进行基因功能或表型预测并计算功能基因或者表型丰度。